ونکومایسین یکی از آنتی‌بیوتیک‌های خانواده بتالاکتام، مصرف بسیار گسترده‌ای در بیمارستان‌ها برای درمان بیماری‌های عفونی دارد. بنابراین اندازه‌گیری دقیق آن در فاضلاب خروجی از بیمارستان‌ها به‏عنوان یک آلاینده نوظهور که باعث مقاومت باکتریایی می‌شود، ضروری می‌باشد. روش کار: در این مطالعه از استخراج فاز جامد برای جداسازی ونکومایسین از فاضلاب بیمارستانی استفاده شد. میزان درصد بازیابی در pHهای 3 و 7 بررسی شد. نمونه‌های استخراج شده با نرخ جریان 8/0 میلی لیتر در دقیقه فاز متحرک بافر استات/ استونیتریل با نسبت‌های متفاوت و در دمای C°20 از میان ستون C18 عبور داده شد. مقدار ونکومایسین در نمونه‌ها با استفاده از کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) مجهز به آشکارساز ماوراء بنفش در طول موج 240 نانومتر تعیین مقدار شدند. یافته‌ها: بهترین شرایط برای استخراج در 7pH= و با 89 درصد بازیابی بدست آمد. اندازه‏گیری با فاز متحرک بافر استات/ استونیتریل با نسبت حجمی 89 به 11 در 4pH= نتایج بهتری نشان داد. در شرایط بهینه، معیار خطی بودن (R2) در محدوده‌های غلظت 45-1 میکروگرم در لیتر و 120-50 میکروگرم در لیتر به ترتیب 97/0 و 96/0 بدست آمد. آستانه تشخیص (LOD) و آستانه تعیین مقدار (LOQ) به‏ترتیب 3 و 10 میکروگرم در لیتر محاسبه گردید. همچنین تغییرات دقت اندازه گیری بر روی نمونه‌های استاندارد در فواصل ساعتی و روزانه هر دو کمتر از 10 درصد نشان داد. نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه می‌تواند به‏عنوان یک دستورالعمل اختصاصی برای استخراج و تعیین مقدار آنتی‌بیوتیک ونکومایسین از نمونه‌های فاضلاب بیمارستانی مورد استفاده قرار گیرد.